Název: Studium funkce a molekulární architektury fungálních nitrilas využitelných v biokatalýze
Překlad názvu: Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Autoři: Veselá, Alicja Barbara ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Typ dokumentu: Disertační práce
Rok: 2015
Jazyk: eng
Abstrakt: [eng] [cze]
Nitrilases are enzymes which catalyze the hydrolysis of a nitrile into the corresponding carboxylic acid and ammonia. These enzymes are potentially applicable in biocatalysis and bioremediation because of their advantages over the conventional (chemical) methods of nitrile hydrolysis (lower demand for energy, safety, simplicity, high yields, selectivity). In this work, genome mining was used to search for the sequences of hypothetical nitrilases from filamentous fungi. The amino acid sequences of previously characterized fungal nitrilases were used as the templates. Then the new synthetic genes together with other genes from our nitrilase library were expressed in E. coli and the substrate specificities of the enzymes thus produced were compared. Significant attention was focused on the relationships between the sequence of the enzyme and its substrate specificity. The arylacetonitrilases from Arthroderma benhamiae (NitAb) and Nectria haematococca (NitNh) were purified and characterized. Their substrate specificities, kinetic parameters, pH and temperature profiles and subunit and holoenzyme size were assessed. NitAb and NitNh together with other recombinant fungal nitrilases were employed in the hydrolysis of high concentrations of (R,S)-mandelonitrile in a batch or fed-batch mode. Nitrilase from... Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1 ). NitAb byla pouze mírně...
Klíčová slova: biokatalýza; cílená mutageneze; heterologní exprese; nitrilasy; nitrily; strukturní analýza; substrátová specifita; biocatalysis; heterologous expression; nitrilase; nitriles; site-directed mutagenesis; structural analysis; substrate specificity

Instituce: Fakulty UK (VŠKP) (web)
Informace o dostupnosti dokumentu: Dostupné v digitálním repozitáři UK.
Původní záznam: http://hdl.handle.net/20.500.11956/80436

Trvalý odkaz NUŠL: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-350090


Záznam je zařazen do těchto sbírek:
Školství > Veřejné vysoké školy > Univerzita Karlova > Fakulty UK (VŠKP)
Vysokoškolské kvalifikační práce > Disertační práce